Cos'è real time pcr?
Real-Time PCR (qPCR)
La Real-Time PCR, anche conosciuta come qPCR (Quantitative PCR), è una tecnica di laboratorio ampiamente utilizzata in biologia molecolare per amplificare e quantificare in tempo reale una specifica sequenza di DNA. A differenza della PCR convenzionale, che quantifica il prodotto amplificato solo alla fine della reazione (end-point analysis), la qPCR monitora l'amplificazione del DNA durante la reazione stessa. Questo permette di determinare la quantità iniziale di DNA bersaglio (template) nel campione originale.
Come funziona:
La qPCR si basa sui principi della PCR, ma incorpora anche un sistema di rilevamento che permette di misurare la quantità di DNA amplificato ad ogni ciclo. Questo sistema di rilevamento si basa generalmente sull'utilizzo di:
- Fluorofori intercalanti: Sostanze chimiche fluorescenti che si legano al DNA a doppio filamento (es. SYBR Green). L'intensità della fluorescenza aumenta proporzionalmente alla quantità di DNA prodotto.
- Probe fluorescenti: Oligonucleotidi specifici per la sequenza bersaglio, marcati con un fluoroforo e un quencher. Durante l'amplificazione, la probe viene degradata dall'attività esonucleasica della DNA polimerasi, separando il fluoroforo dal quencher e generando un segnale fluorescente. Esistono diverse tipologie di probe, tra cui TaqMan probes, Molecular Beacons e Scorpion primers.
Fasi della qPCR:
- Preparazione del campione: Estrazione del DNA o RNA (che viene poi retrotrascritto in cDNA per la Reverse Transcription PCR (RT-PCR)).
- Impostazione della reazione: Miscelazione del DNA/cDNA con primer specifici per la sequenza bersaglio, una DNA polimerasi, nucleotidi, buffer e il fluoroforo/probe.
- Cicli di PCR: La reazione viene eseguita in un termociclatore real-time, che alterna cicli di denaturazione, annealing (appaiamento dei primer) ed estensione. Durante ogni ciclo, la fluorescenza viene misurata.
- Analisi dei dati: I dati di fluorescenza vengono utilizzati per generare una curva di amplificazione. Si calcola il Ct value (Cycle threshold), che rappresenta il numero di cicli necessari affinché il segnale fluorescente superi una soglia definita. Il Ct value è inversamente proporzionale alla quantità iniziale di DNA bersaglio.
Applicazioni:
La qPCR ha numerose applicazioni in diversi campi, tra cui:
- Diagnostica medica: Rilevamento di agenti patogeni (virus, batteri, funghi) e quantificazione della carica virale. Diagnostica molecolare di malattie genetiche.
- Ricerca genetica: Espressione genica, analisi di trascritti alternativi.
- Microbiologia: Quantificazione di microorganismi in campioni ambientali.
- Agricoltura: Rilevamento di OGM e patogeni vegetali.
Vantaggi:
- Alta sensibilità: Permette di rilevare anche piccole quantità di DNA bersaglio.
- Quantificazione accurata: Fornisce una misura quantitativa della quantità iniziale di DNA.
- Elevata specificità: Utilizzo di primer e/o probe specifici per la sequenza bersaglio.
- Rapidità: Risultati ottenibili in poche ore.
- Monitoraggio in tempo reale: Permette di seguire l'amplificazione del DNA durante la reazione.
Limitazioni:
- Suscettibilità a contaminazioni: Richiede rigorose procedure per prevenire la contaminazione del campione.
- Necessità di standardizzazione: Richiede l'utilizzo di standard per quantificare accuratamente il DNA bersaglio.
- Design dei primer e delle probe: Richiede una progettazione accurata dei primer e delle probe per garantire la specificità e l'efficienza dell'amplificazione.
- Costo: Costo elevato delle apparecchiature e dei reagenti.